Ein sehr berühmter SNP betrifft das Gen beta-Globin, das für einen Bestandteil des Hämoglobins codiert: Der Austausch des 20. Nukleotids ab dem Startcodon (von A nach T) führt zum Einbau eines Valins statt einer Glutaminsäure, was großen Einfluss auf Struktur und Funktion des gesamten Proteins und letztlich sogar auf die Erythrocyten selbst hat. Das veränderte Hämoglobin kann Sichelzellanämie hervorrufen. Im Folgenden werden wir uns eingehend mit besagtem SNP beschäftigen.
Dazu werden wir alle Schritte vorbereiten, die nötig sind, um humane DNA-Proben dahingehend zu untersuchen, ob das Gen beta-Globin in seiner Wildtypform oder in der eben beschriebenen mutierten Form vorliegt (oder ob die DNA-Probe von einem heterozygoten Menschen stammt).
Weiterführende Informationen zur Sichelzellanämie (z.B. zur Frage, wie das Verändern eines einzigen Proteins die Struktur der gesamten Zelle beeinflussen kann), finden sich am Ende dieser Seite im Exkurs.

Folgen Sie dem unten stehenden Link, um die Sequenz des humanen Gens für beta-Globin zu erhalten:
NCBI nucleotide (Für das beta-Globin Gen liegen viele Versionen für die zahlreichen Varianten vor; es würde an dieser Stelle zu weit führen diese Varianten zu erklären. Deshalb ist in dem Link zu NCBI Nucleotide die Suche nach der für uns richtigen Variante bereits integriert.)

Klicken Sie rechts oben (siehe nächstes Bildschirmfoto) auf 'Send', dann auf 'complete record', 'file' und 'GenBank (full)'. Nach Klick auf 'Create File' wird eine Datei mit dem Namen sequence.gb heruntergeladen.

Richten Sie in Benchling das Projekt 'Globin' ein und importieren Sie dann eine neue DNA ('das blaue +' --> 'import DNA').
Im aufgehenden Fenster wählen Sie dann die gerade von NCBI heruntergeladene Datei aus, und klicken nach dem Hochladen auf 'Close'.
Auf der linken Seite erscheint nun eine neue Zeile mit der Beschriftung 'KU350152'. Klicken Sie mit der rechten Taste auf die Beschriftung und wählen Sie 'Rename'. Vergeben Sie "Humanes beta-Globin" als neuen Namen.

Die 20. Base der codierenden Sequenz in der Wildtypform von beta-Globin ist ein Adenin. In der von uns betrachteten mutierten Form ist dieses Adenin durch ein Thymin ersetzt. Zur besseren Übersichtlichkeit werden wir nun die 20. Base annotieren, sodass sie auch grafisch hervorgehoben ist. Gehen Sie vor wie folgt:
Setzen Sie den Mauszeiger an den Start der codierenden Sequenz (Start Codon ATG!). Halten Sie die linke Maustaste gedrückt und fahren Sie nach rechts, bis Sie die 20. Base markiert haben (Sie können unten bei 'Length' mitlesen). Ist die 20. Base ein 'A' (in der oberen Sequenz)? Sehr gut. Dann markieren Sie nun nur dieses Adenin.
Klicken Sie dann auf das Symbol für Annotationen (in Benchling auf der rechten Seite das oberste Symbol). Gehen Sie auf 'new annotation' und vergeben Sie unter 'Name' einen Namen, z.B. SNP A-->T. Klicken Sie auf 'Save Annotation'.
Nun ist der SNP annotiert. Da es sich nur um eine Base handelt, ist die Markierung in der Sequenz allerdings nicht besonders auffällig.

Das Restriktionsenzym das wir später verwenden werden und das nur eine der beiden von uns betrachteten Varianten des Gens (also nur eines der beiden Allele) schneidet, heißt 'Bsu36I'. Dieses Enzym ist in der umfangreichen Enzym-Datenbank von Benchling bereits enthalten. Zur Markierung der für uns interessanten Schnittstelle gehen Sie wie folgt vor:
Klicken Sie in Benchling auf der rechten Seite auf das Symbol 'Digest'. Geben Sie dann in der Zeile 'Find Enzyme' den Namen des Enzyms ein. Dieses erscheint daraufhin unten in der Auswahlliste. Klicken Sie dort auf den Enzymnamen. Sie sehen nun Links oben in diesem Fenster die Sequenz die von dem Enzym erkannt wird: CCTNAGG. Die kleinen Dreiecke zeigen die exakten Schnittpositionen an. Das 'N' steht hierbei für eine beliebige Base.

Klicken Sie erneut auf das Symbol 'Digest', um das Fenster wieder zuzuklappen. Die Schnittstellen von Bsu36I sind nun in der Sequenz von beta-Globin farblich hervorgehoben.
Führen Sie nun alle notwendigen Schritte aus, um die Restriktionsschnittstelle mit dem Namen des Enzyms zu annotieren.

Als nächstes werden wir eigene Primer erstellen, um aus humanen DNA-Proben gezielt den Abschnitt des beta-Globingens amplifizieren zu können, der den gesuchten SNP mit einschließt. Die Primer sollten dabei so gelegt werden, dass alle zu erwartenden Fragmente später in der Gelelektrophorese gut erkennbar und voneinander unterscheidbar sind. Aus diesem Grund wählen Sie nun die Basen 380 – 697 aus und kopieren Sie diese Sequenz.
(Markieren – Rechtsklick auf die Sequenz – 'Copy' – im aufgehenden Fenster in das Feld links oben ('Sequence') klicken)

Gehen Sie zu Primer-BLAST und geben Sie dort die Sequenz ein. Verändern bzw. setzen Sie folgende Parameter:
Product Size: 280 – 1000 (Roter Pfeil im Bildschirmfoto)
Specificity check: aus (Roter Pfeil im Bildschirmfoto)
Klicken Sie auf 'Get Primers' (ganz unten auf der Seite).

Primer-BLAST erstellt nun 10 Primerpaare, die den gesetzten Parametern entsprechen, wobei das erste Paar den Parametern am besten entspricht. Wählen Sie das erste auf der Ergebnisseite angezeigte Primerpaar und legen Sie die Sequenzen als Primer (Oligos) in Benchling an. Achten Sie dabei auf den Speicherort in Benchling und eine sinnvolle Bezeichnung der beiden Primer (Oligos). Wenn Sie nicht mehr wissen, wie Primer in Benchling angelegt werden, dann sehen Sie auf der Seite "Grundsätzliches Arbeiten mit Benchling" im Abschnitt "Primersequenzen hinzufügen" nach.

Binden Sie nun das Primerpaar an die Gensequenz. Wenn Sie nicht mehr wissen, wie dies in Benchling umgesetzt wird, können Sie dies auf der Seite "Grundsätzliches Arbeiten mit Benchling" im Abschnitt "Ermitteln der Primerbindestellen" nachlesen. Achten Sie darauf, dass in dem Feld 'Use primers in' der Speicherort der eben angelegten Primer angegeben ist.

Als nächsten Schritt werden wir eine virtuelle PCR durchführen, also eine DNA-Sequenz erstellen wie man sie nach einer PCR mit unseren Primern und einer humanen DNA-Probe erwarten würde.
Nach Einblenden der 'Sequence Map' klicken Sie auf den Forward Primer, halten die Shift Taste gedrückt und klicken anschließend auf den Reverse Primer, um die gesamte dazwischenliegende Sequenz inkl. Primer zu markieren.

Klicken Sie dann mit der rechten Taste auf irgendeine der markierten Basen und im erscheinenden Kontextmenü auf 'Create New DNA'. Kontrollieren Sie, dass im daraufhin erscheinenden Fenster dieselben Optionen ausgewählt sind wie im folgenden Bildschirmfoto gezeigt.

Vergeben Sie für die neu geschaffene Sequenz den Namen "PCR Produkt beta-Globin Wildtyp" (blaue Zeile links).
Nun benötigen wir die Sequenz noch in ihrer mutierten Form. Klicken Sie mit der rechten Taste auf den neu vergebenen Namen und dann auf 'Copy To...'. Im erscheinenden Fenster bestätigen Sie mit 'Copy'. Die dann neu angelegte Sequenz benennen Sie bitte um in: "PCR Produkt beta-Globin mutiert".
Noch ist die Sequenz aber gar nicht mutiert, dafür sorgen wir erst jetzt. Da der SNP von uns bereits annotiert wurde, ist es leicht, die betreffende Stelle ausfindig zu machen. Markieren Sie das zu mutierende Adenin und geben Sie über die Tastatur ein "T" ein. Die Nachfrage, ob eine Base durch ein "T" ersetzt werden soll bestätigen Sie. Schon haben wir das PCR Produkt generiert, wie es nach einer PCR mit der DNA Probe eines Menschen der das mutierte Allel trägt, zu erwarten ist.

Als letzten Schritt werden wir nun einen virtuellen Restriktionsverdau durchführen, um uns dann ein virtuelles Gel anzeigen zu lassen. Dieses entspricht dann dem erwarteten Ergebnis, wenn das gesamte Experiment mit echten DNA-Proben durchgeführt würde.
Dazu wählen Sie in Benchling auf der linken Seite das PCR Produkt mit der Wildtypsequenz an und klicken ganz rechts auf das Symbol 'Digest'. Wählen Sie das Enzym Bsu36I und klicken Sie anschließend auf 'Run Digest'.
Wiederholen Sie diese Schritte mit der mutierten Sequenz.
Klicken Sie anschließend in Benchling auf 'Virtual Digest' (roter Pfeil im folgenden Bildschirmfoto), um sich das virtuelle Gel anzeigen zu lassen.

Sie können nun mit der Maus auf jedes der erzeugten Fragmente zeigen, um sich über dem Gel die exakte Länge des Fragments anzeigen zu lassen.
Das war's. Wir haben das gesamte Experiment theoretisch vorgeplant, eine konkrete Erwartung für das Gel formuliert und könnten nun direkt die Primer bei einem kommerziellen Anbieter bestellen.
Bei Vorliegen von geeigneten DNA-Proben könnten wir nun also analysieren, welche Allele des beta-Globingens (bezogen auf den betrachteten SNP) die betreffende Person besitzt.

...zur Sichelzellanämie ist folgende: Wie kann das Verändern der Aminosäuresequenz von beta-Globin das äußere Erscheinungsbild der Erythrocyten so gravierend beeinflussen? Schließlich handelt es sich bei Hämoglobin ja nicht um einen Bestandteil des Cytoskeletts, sondern um ein im Cytoplasma der Erythrocyten vorkommendes Molekül mit Funktionen im Transport von O₂ und CO₂. Anschaulich gezeigt ist die Lösung auf diese Frage in der Protein Data Base in der Rubrik Protein of the Month auf der Seite Hämoglobin.